鳥羽・伏見の戦いにおいて敗れた新選組は幕府軍艦で江戸に戻る。3月、幕府の命を受け、大久保剛と改名した近藤は甲陽鎮撫隊として隊を再編し甲府へ出陣したが、甲州勝沼の戦いで新政府軍に敗れて敗走し、その際、意見の対立から永倉新八、原田左之助らが離別する。その後、大久保大和と再度名を改め、旧幕府歩兵らを五兵衛新田（現在の東京都足立区綾瀬四丁目）で募集し、4月には下総国流山（現在の千葉県流山市）に屯集するが、新政府軍に包囲され、越谷（現在の埼玉県越谷市）の政府軍本営に出頭する。
しかし、大久保が近藤と知る者が政府軍側におり、そのため総督府が置かれた板橋宿まで連行される。近藤は大久保の名を貫き通したが、元隊士で御陵衛士の一人だった加納鷲雄に近藤と看破され、捕縛された。その後、土佐藩と薩摩藩との間で、近藤の処遇をめぐり対立が生じたが、結局、4月25日、平尾一里塚（現在の東京都北区滝野川）で斬首された。斬首される直前、近藤は「楽しかったな。」と言ったという[要出典]。35歳（満33歳没）。首は板橋と大坂の千日前、京都の三条河原で梟首された。その後の首の行方は不明である。
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